細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁。

1. 簡(jiǎn)介

2. 原理與技術(shù)

3. 空穴效應(yīng)

4. 撞擊效應(yīng)

5. 剪切效應(yīng)

6.  應(yīng)用介紹

 6.1.? 細(xì)胞破碎（大腸桿菌，酵母菌，細(xì)菌等）

 6.2.? 保持細(xì)胞活性

 6.3.? 細(xì)菌

 6.4.? 酵母菌

 6.5.? 真菌

 6.6? 植物細(xì)胞

7.  細(xì)胞破碎技術(shù)及常用方法

 7.1.  機(jī)械法

 7.2.非機(jī)械法

? 簡(jiǎn)介

細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，蛋白質(zhì)可以大規(guī)模生產(chǎn)。

? 原理與技術(shù)

超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式。

高壓均質(zhì)機(jī)是由一個(gè)高壓柱塞泵及特殊結(jié)構(gòu)的均質(zhì)閥組成，需處理的物料在柱塞所造成的高壓條件下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中，失壓后的物料從可調(diào)節(jié)限流縫隙中以極高的流速（1000米/秒，最高可達(dá)1500米/秒）噴出，撞在閥組件之一的沖擊環(huán)上。

空穴效應(yīng)

被柱塞壓縮的物料內(nèi)積聚了極高的能量，通過可調(diào)節(jié)限流縫隙時(shí)瞬間失壓，造成高能釋放引起空穴爆炸，致使物料強(qiáng)烈粉碎細(xì)化。（主要應(yīng)用于均質(zhì)）

撞擊效應(yīng)

通過可調(diào)節(jié)限流縫隙的物料以上述極高的速度，撞擊到用特殊材料制成的的沖擊環(huán)上，造成物料粉碎。（主要應(yīng)用于細(xì)胞破碎）

剪切效應(yīng)

高速物料通過泵腔內(nèi)通道和閥口狹縫時(shí)會(huì)產(chǎn)生剪切效應(yīng)。被三種效應(yīng)處理過的物料可均勻細(xì)化到0.03μm-2μm粒徑。（主要應(yīng)用于乳化）

? 應(yīng)用介紹

細(xì)胞破碎（大腸桿菌，酵母菌，細(xì)菌等）

利用大腸桿菌、酵母等菌種進(jìn)行發(fā)酵，然后經(jīng)過破壁后提取細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)等活性的產(chǎn)物是生物工程中的重要技術(shù)。而這些工藝中很重要的一步就是細(xì)胞破碎。

保持細(xì)胞活性

保持細(xì)胞活性的最重要參數(shù)是溫度和時(shí)間，物料在高壓均質(zhì)閥內(nèi)部的約0.01秒的瞬間，在高壓的作用下溫度會(huì)上升到大約10～15℃。

通過均質(zhì)閥后在經(jīng)過高效換熱器的作用下，溫度在2~3秒作用會(huì)迅速下降，所以物料在溫度相對(duì)較高的條件下僅僅維持最多3秒鐘。

細(xì)菌

幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。短肽一般由四或五個(gè)胺基酸組成，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-賴氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大。

酵母菌

酵母細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。

真菌

霉菌的細(xì)胞壁主要存在三種聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷鍵連接，某些以β-1,6糖苷鍵連接），幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白。最外層是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來，第3層主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層主要是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。

植物細(xì)胞

對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期形成的。 次生壁是細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，在初生壁內(nèi)部形成的結(jié)構(gòu)。 較流行的初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由Lampert等人提出的“經(jīng)緯”模型，依據(jù)這一模型，纖維素的微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向一層一層敷著在上面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同，互成一定角度，形成獨(dú)立的網(wǎng)路，構(gòu)成了細(xì)胞壁的“經(jīng)”，模型中的“緯”是結(jié)構(gòu)蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細(xì)胞質(zhì)分泌，垂直于細(xì)胞壁平面排列，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)路系統(tǒng)。半纖維素和果膠等膠體則填充在網(wǎng)路之中，從而使整個(gè)細(xì)胞壁既具有剛性又具有彈性。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。

? 細(xì)胞破碎技術(shù)

破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。

機(jī)械法

?高壓勻漿破碎法（homogenization）

高壓勻漿器是常用的設(shè)備，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，由于突然減壓和高速?zèng)_擊，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞。

?振蕩珠擊破碎法 (Skaking Bead)

將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中，再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積，用6500RPM振湯機(jī)高速上下振動(dòng)8秒，休息8秒，再振動(dòng)8秒即可。此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。 一臺(tái)機(jī)器最多可以在一天處理2400支樣品。對(duì)小量且多樣的人很方便。

?高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding）

研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī) 。

?超聲波破碎法（ultrasonication）

超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式。

非機(jī)械法

?滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock）

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。

?凍融破碎法（freezing and thawing）

將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反覆多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。

?酶溶破碎法（enzyme lysis）

酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。

?化學(xué)破碎法（chemical treatment）

采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑。

?去垢劑破碎法（detergents）

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